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Nature:利用CRISPR-Cas9鉴定出AML白血病的新药物靶标—METTL3

近日,英国剑桥大学等科研机构的科研人员在Nature上发表了题为“Prioritization
of cancer therapeutic targets using CRISPR–Cas9
screens”的文章,研究人员基于功能基因组学,利用CRISPR-Cas9系统对多种癌症治疗的潜在靶标进行筛选,为癌症治疗提供新的思路。

在一项新的研究中,来自美国达纳-法伯癌症研究所和波士顿儿童医院癌症与血液疾病中心等研究机构的研究人员开发出一种新的筛查方法,即利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术在小鼠体内测试上千个肿瘤基因的功能。他们利用这种方法揭示出新的药物靶标,从而可能潜在地改进PD-1检查点抑制剂的疗效。相关研究结果于2017年7月19日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“In
vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy
target”。论文通信作者为小儿科肿瘤学家W. Nick Haining博士。

急性骨髓性白血病是一种侵袭性的血癌,会影响所有年龄段的人,通常需要数月的强化化疗和长时间的住院。它的形成过程是骨髓中的异常细胞将健康的细胞挤出,进而导致危及生命的感染和出血。几十年来,主流的AML治疗方法一直保持不变,但是每三名患者中只有不到一人能够在这种癌症中存活下来。

目前,癌症治疗药物的开发存在一定限制,如缺乏靶标高效鉴定的方法和临床疗效较差等,功能基因组学方法可以克服这些限制。研究人员对来自30种癌症类型的324种人类癌细胞系,进行了基因组规模的CRISPR-Cas9筛选,并开发了名为Project
Score的在线数据库(

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研究人员通过开发的新方法分析发现,Werner综合征ATP依赖性解旋酶是多种癌症类型肿瘤的合成致死靶标,并具有微卫星不稳定性(MSI)。本研究为癌症治疗药物的开发提供了全新高效的靶标库。(摘译自Nature,
Published: 10 April 2019)

图片来自Nature,doi:10.1038/nature23270

图片来自Wikipedia

这些研究人员报道剔除肿瘤细胞中的Ptpn2基因会使得它们对PD-1检查点抑制剂更加敏感。这些抑制剂释放免疫细胞上的“车闸”,使得它们能够发现和摧毁和癌细胞。

为了鉴定出治疗AML的潜在新方法,来自英国韦尔科姆基金会桑格研究所、剑桥大学格登研究所等研究机构的研究人员在一项新的研究中,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术筛选AML细胞的弱点。他们构建出携带着在人AML细胞中可能需要加以靶向的基因发生突变的小鼠白血病细胞,并且系统性地测试每个基因,以便发现哪些基因是AML细胞存活所必需的。

Haining说,“PD-1检查点抑制剂改变了很多癌症的治疗。尽管这类新的癌症免疫疗法在临床上取得成功,但是大多数患者并没有从PD-1阻断中获得临床益处。”

这些研究人员最终筛选到46个潜在的候选基因,它们中的多数产生能够修饰RNA的蛋白。在这些基因当中,METTL3是具有最强影响的基因之一。他们发现尽管METTL3是AML细胞存活所必需的,但是它并不是健康的血细胞所必需的,这就使得它成为一种不错的潜在药物靶标。相关研究结构于2017年11月27日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“Promoter-bound
METTL3 maintains myeloid leukaemia by m6A-dependent translation
control”。

Haining说,这就促发人们进一步开展大量的临床试验来研究当与PD-1抑制剂联合使用时的其他药物是否能够增加对这种疗法作出反应的患者数量。

剑桥大学格登研究所的Tony
Kouzarides教授说,“治疗AML的新方法是迫切需要的,而且我们一直在寻找可能成为不错的药物靶标的基因。我们鉴定出甲基转移酶METTL3是一种抵抗AML的高度可行的靶标。我们的研究将促使人们努力开发出通过特异性地抑制METTL3来治疗AML的药物。”

Haining说,“迄今为止所面临的挑战一直都是发现最为有效的免疫治疗靶标和优选发现那些与PD-1抑制剂联合使用发挥最好效果的靶标。因此,我们着手开发一种更好的系统来鉴定新的药物靶标,这些药物靶标可能协助身体自身的免疫系统攻击癌症。”

为了让蛋白在细胞中产生,DNA先经转录产生信使RNA,随后mRNA经翻译产生细胞所需的蛋白。然而对mRNA进行修饰能够控制蛋白是否会产生。这就是最近发现的一种基因调节方式:RNA编辑。

Haining继续说道,“我们的研究提示着大量的生物学途径可能能够被靶向,从而使得免疫疗法取得更大的成功。令人吃惊的是,其中的很多途径是我们从未预测过的。比如,若没有这种筛选技术,Ptpn2明显地就不会是癌症免疫疗法的一种好的药物靶标。”

在发现METTL3是一种潜在的药物靶标之后,这些研究人员研究了它的作用机制。他们发现METTL3蛋白结合到126个不同的基因的启动子上。随后,当mRNA产生时,METTL3蛋白将甲基基团添加到这些mRNA的中间部分,这种现象是之前没有观察到的。

为了广撒网,论文第一作者、Haining实验室研究生Robert
Manguso设计出一种基因筛选系统来鉴定癌细胞用来躲避免疫攻击的基因。他利用CRISPR-Cas9系统性地敲除黑色素瘤细胞表达的2368个基因。CRISPR-Cas9像一把分子剪刀那样发挥作用,在遗传密码的特定位点准确地切割DNA。Manguso随后能够鉴定出哪些基因当被剔除时会使得这些癌细胞对PD-1阻断更加敏感。

这些研究人员发现这些位于中间部分的甲基增加这些mRNA翻译为蛋白的能力。他们随后证实当METTL3受到抑制时,没有甲基添加到mRNA上,因而这就会阻止AML细胞产生它们必需的蛋白,这样它们就开始死掉。

Manguso先是对黑色素瘤细胞进行基因改造,使得它们所有都含有Cas9,即作为CRISPR编辑系统一部分的“切割”酶。随后,通过使用一种病毒运送工具,他利用不同的“单向导RNA”对每个癌细胞进行编程。通过与Cas9酶一起使用,这些sgRNA能够清除2368个不同的基因。

论文共同第一作者Konstantinos
Tzelepis博士说,“这项研究揭示了AML中的一种全新的基因调节机制,该机制通过RNA修饰运行着。我们发现抑制METTL3的甲基转移酶活性会阻止这种白血病所需的一整套蛋白表达。这种机制表明抑制甲基化的药物可能有效地抵抗AML,而且并不影响正常的细胞。”

通过注射这些肿瘤细胞到小鼠体内和利用PD-1检查点抑制剂治疗这些小鼠,Manguso随后能够统计哪些接受编程的肿瘤细胞存活下来。那些死掉的肿瘤细胞因发生基因缺失而对PD-1阻断敏感。
利用这种方法,Manguso和Haining首次证实了已知的两种免疫逃避基因的作用,靶向它们的抑制剂药物已用于临床试验中。他们随后发现许多新的免疫逃避基因,如果通过治疗手段加以抑制,就能够改进PD-1癌症免疫疗法。特别令人关注的是,其中的一个新发现的基因是Ptpn2。

韦尔科姆基金会桑格研究所的George
Vassiliou博士说,“AML是一种可怕的疾病,影响着世界各地的人群,然而我们的治疗方法几十年来变化不大,而且大部分患者的治疗结果仍然比较差。我们认为我们必须具有不同的想法,并且寻找新的方法来治疗这种疾病。令人兴奋的是,我们在METTL3中发现了一种新的药物靶标。我们希望这一发现将导致人们开发出更有效的疗法,从而改善AML患者的存活和生活质量。”

Haining说,“Ptpn2通常会抑制让癌细胞窒息的免疫信号通路。剔除Ptpn2会激活这些免疫信号通路,使得肿瘤细胞生长得更慢,而且当遭受免疫攻击时更容易死掉。”

原始出处:Isaia Barbieri, Konstantinos Tzelepis, Luca Pandolfini et
al.Promoter-bound METTL3 maintains myeloid leukaemia by m6A-dependent
translation control. Nature, Published online: 27 November 2017,
doi:10.1038/nature24678

利用这种新的筛选方法,Haining团队正在快速地扩大他们的工作以便进一步寻找新的可能增强免疫治疗的药物靶标。

Haining说,他们正在扩大他们的方法:从一次筛选几千个基因到最终能够筛选整个基因组,从筛选黑色素瘤到筛选结肠癌、肺癌和肾癌等。

与此同时,尽管更多新的潜在药物靶标即将出现,Haining团队正在基于他们关于Ptpn2的发现采取行动。

Haining说,“我们正在努力思考Ptpn2抑制剂看起来像是什么样子。很容易想象制造一种关闭Ptpn2的小分子药物。”

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